РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ)

Распределительная хроматография основана на использовании различий в растворимости распределяемого вещества в двух контактирующих несмешивающихся жидких фазах. Обе фазы - ПФ и НФ - представляют собой жидкие фазы. При перемещении жидкой ПФ вдоль жидкой же НФ хроматографируемые вещества непрерывно перераспределяются между обеими жидкими фазами.

К распределительной хроматографии относится бумажная хроматография (или хроматография на бумаге) в ее обычных вариантах. В этом методе вместо пластинок с тонким слоем сорбента, употребляемых при ТСХ, применяют специальную хроматографическую бумагу, по которой, пропитывая ее, перемещается жидкая ПФ во время хроматографирования от линии старта до линии финиша растворителя.

Различают нормальнофазовую и обращеннофазовую бумажную хроматографию.

В варианте нормальнофазовой бумажной хроматографии жидкой НФ является вода, сорбированная в виде тонкого слоя на волокнах и находящаяся в порах гидрофильной бумаги (до 25% по массе). Эта связанная вода по своей структуре и физическому состоянию сильно отличается от обычной жидкой воды. В ней и растворяются компоненты разделяемых смесей.

Роль ПФ, перемещающейся по бумаге, играет другая жидкая фаза, например, органическая жидкость с добавлением кислот и воды. Жидкую органическую ПФ перед хроматографированием насыщают водой для того, чтобы ПФ не растворяла в себе воду, сорбированную на волокнах гидрофильной хроматографической бумаги.

Хроматографическая бумага выпускается промышленностью. Она должна отвечать ряду требований: готовиться из высококачественных волокнистых сортов хлопка, быть однородной по плотности и толщине, по направлению ориентирования волокон, химически чистой и инертной по отношению к НФ и разделяемым компонентам.

В нормальнофазовом варианте в качестве ПФ чаще всего применяют жидкие смеси, составленные из различных растворителей. Классическим примером такой ПФ является смесь уксусной кислоты, н-бутанола и воды в объемном отношении 1:4:5. Используют и такие растворители, как этилацетат, хлороформ, бензол и т. д.

В варианте обращеннофазовой бумажной хроматографии жидкая НФ представляет собой органический растворитель, тогда как в роли жидкой ПФ выступает вода, водные или спиртовые растворы, смеси кислот со спиртами. Процесс проводят с использованием гидрофобной хроматографической бумаги. Её получают обработкой (пропиткой) бумаги нафталином, силиконовыми маслами, парафином и т. д. Неполярные и малополярные органические растворители сорбируются на волокнах гидрофобной бумаги и проникают в ее поры, образуя тонкий слой жидкой НФ. Вода не удерживается на такой бумаге не смачивает ее.

Техника бумажной хроматографии в общих чертах такая же, как и в методе ТСХ. Обычно на полоску хроматографической бумаги на линию старта наносят кашпо анализируемого раствора, содержащего смесь разделяемых веществ. После испарения растворителя бумагу ниже линии старта погружают в ПФ, располагая бумагу вертикально (подвешивая ее). Закрывают камеру крышкой и проводят хроматографирование до тех пор, пока ПФ не достигнет обозначенной на бумаге линии фронта растворителя. После этого процесс прерывают, бумагу сушат на воздухе и проводят детектирование пятен и идентификацию компонентов смеси.

Бумажная хроматография подобно методу ТСХ применяется как в качественном, так и в количественном анализе.

Для количественного определения содержания того или иного компонента смеси применяют различные методы:

• 1) исходят из наличия определенной зависимости (пропорциональной, линейной) между количеством вещества в пятне и площадью пятна (часто при этом предварительно строят градуировочный график);
• 2) взвешивают вырезанное пятно с веществом и такую же по площади чистую бумагу, а затем по разности находят массу определяемого вещества;
• 3) учитывают связь между интенсивностью окраски пятна и содержания в нем определяемого компонента, придающего окраску пятну.

В ряде случаев вещества, содержащиеся в пятнах, экстрагируют каким-либо растворителем и затем анализируют экстракт.

Бумажная хроматография - фармакопейный метод, используется для разделения смесей, содержащих как неорганические, так и органические вещества. Метод доступен, прост по выполнению, однако в целом он уступает более современному методу ТСХ, в котором применяется тонкий слой сорбента.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Хроматография ОФС.1.2.1.2.0002.15

на бумаге Взамен ст. ГФ XI , вып.1

Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы, называется хроматографией на бумаге.

Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, предварительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным или адсорбционным. Перемещение подвижной фазы происходит либо только под действием капиллярных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).

При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге зоны адсорбции в виде круглых или овальных пятен или полос в зависимости от способа нанесения (в точку или полосой). Совокупность зон адсорбции, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хроматограммой.

Подвижность вещества при хроматографировании характеризуется фактором удерживания R f , (см. ).

Область применения

Бумажная хроматография может использоваться для установления подлинности, чистоты и количественного определения анализируемого вещества.

Подлинность подтверждается при одновременном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и стандартного вещества. Если образцы идентичны, то соответствующие им зоны адсорбции на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения R f . Для идентификации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и стандартного вещества. На хроматограмме должно наблюдаться одно пятно, характеризующее зону адсорбции. Условия хроматографирования следует подбирать так, чтобы значения R f были отличны от 0 и не превышали 1. Кроме того, для подтверждения подлинности анализируемого вещества могут быть использованы конкретные условия его детекции, указанные в фармакопейной статье.

При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество должны иметь разные значения R f . О степени чистоты анализируемого вещества можно судить по величине и интенсивности окраски (или поглощения) обнаруживаемых на хроматограмме зон адсорбции примесей. Содержание примесей может быть определено полуколичественно. Для этого на одном листе бумаги одновременно хроматографируют определенное количество анализируемого вещества и несколько образцов определяемой примеси (свидетеля) c различными, точно известными концентрациями. Содержание примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее зону адсорбции на хроматограмме по совокупности площади зоны адсорбции и интенсивности окраски (или поглощения) с зонами адсорбции свидетеля.

Для количественного анализа применяют специальные приборы, позволяющие проводить измерения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для обработки хроматограмм в видимой области спектра целесообразно использовать планшетные сканеры и соответствующее программное обеспечение.

можно также проводить количественное определение веществ после их экстракции с хроматограммы. Для этого зоны адсорбции вырезают и экстрагируют определяемое вещество подходящим растворителем. Содержание анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке после отгонки растворителя находят любым методом, пригодным для определения малых концентраций и учитывающим строение анализируемого вещества.

Проба испытуемой смеси может наноситься либо точечно на линию старта, либо в виде равномерной полосы вдоль всей линии старта, при этом первичная зона адсорбции будет иметь вид пятна, а во втором случае – полосы, параллельной линии старта.

Оборудование

Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизированные камеры, изготовленные из инертного материала и позволяющие наблюдать за ходом процесса разделения при закрытой крышке камеры. Часто в качестве камер используют стеклянные стаканы или цилиндры с пришлифованной крышкой и дополнительно герметизированные. На крышке могут быть входные отверстия (шлюзы) для добавления растворителя или снятия избыточного давления в камере.

При проведении нисходящей хроматографии в верхней части камеры помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения, по крайней мере, однократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать ширину листа хроматографической бумаги. Камера должна быть снабжена устройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем положении и для ввода в лодочку подвижной фазы.

При проведении восходящей хроматографии подвижную фазу помещают либо в лодочку, установленную в нижней части камеры, либо наливают на дно камеры.

Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворителей, входящих в состав подвижной фазы.

Подготовку оборудования, хроматографической бумаги и подвижной фазы приводят в фармакопейных статьях.

Методики хроматографического разделения

Бумажная хроматография может быть одномерной и двумерной.

Одномерная бумажная хроматография предполагает точечное нанесение или нанесение в виде полосы пробы исследуемой смеси на линию старта и последующее хроматографирование в одном направлении (рис. 1).

Рисунок 1 – Примерная схема одномерной бумажной хроматографии

Двумерная хроматография предполагает последовательное прохождение подвижной фазы в двух перпендикулярных направлениях, что позволяет обеспечить более четкое разделение смеси анализируемых веществ (рис. 2).

Рисунок 2 – Примерная схема двумерной бумажной хроматографии

Нисходящая хроматография

На дно хроматографической камеры помещают неподвижную или подвижную фазу в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 2,5 см. Камеру закрывают и оставляют для насыщения на 24 ч при постоянной температуре. В отдельных случаях, при использовании достаточно летучих растворителей, это время может быть сокращено.

Растворы веществ наносят на линию старта микропипеткой или микрошприцем так, чтобы расстояние между точками нанесения отдельных проб было не менее 3 см. Если минимальное, необходимое для проведения хроматографирования количество анализируемого раствора может образовывать на бумаге первичную зону адсорбции в виде пятна, превышающего в диаметре 10 мм, нанесение проводят в несколько приемов, предотвращая путем подсушивания чрезмерную диффузию на линии старта. После нанесения растворов анализируемых веществ и высыхания образовавшейся при этом первичной хроматограммы полосу бумаги закрепляют в рабочем положении в камере и оставляют на 1,5 ч. В рабочем положении полоса хроматографической бумаги должна висеть вертикально так, чтобы между ее верхним концом, погруженным в лодочку, и линией старта был лишь один, по возможности плавный, перегиб. По окончании выдержки начинают хроматографирование, для чего в лодочку вливают подвижную фазу. Хроматографирование обычно заканчивают при приближении фронта подвижной фазы к нижнему концу полосы бумаги. Если в фармакопейной статье нет специальных указаний, полосу вынимают из камеры и сушат на воздухе, отметив графитовым карандашом конечное положение фронта подвижной фазы. Детекцию зон адсорбции осуществляют согласно указаниям фармакопейной статьи.

Восходящая хроматография

Для проведения восходящей хроматографии на бумаге используют камеры, в которых сосуд (лодочка) с подвижной фазой располагается в нижней части или на дне. Полоса хроматографической бумаги закрепляется в верхней части камеры так, чтобы обеспечить возможность погружения нижнего конца полосы в лодочку с подвижной фазой. В рабочем положении полосы линия старта должна отстоять от поверхности подвижной фазы на 2 – 3 см. В остальном приемы работы при проведении восходящей хроматографии на бумаге не отличаются от описанных выше.

Подготовка фаз и бумаги

При приготовлении несмешивающихся систем растворителей, совместно используемых при хроматографии в качестве подвижной и неподвижной фазы, необходимо обеспечить их взаимное насыщение, например, путем встряхивания в делительной воронке. При этом в фармакопейной статье должно быть указано, какую из фаз используют для хроматографирования.

Фильтровальную бумагу нужной плотности квалификации «для хроматографии» разрезают в направлении, перпендикулярном или параллельном волокнам, на листы (полосы), длина которых приблизительно равна высоте камеры. Ширина этих полос может быть приблизительно определена по формуле: А = 3(К + 1), где А – ширина полосы (см), К – количество хроматограмм на полосе.

На каждой полосе бумаги для обозначения мест нанесения хроматографируемых веществ графитовым карандашом проводят прямую линию, называемую линией старта. Расстояние от конца полосы бумаги до линии старта выбирается так, чтобы при погружении бумаги в лодочку исключалось непосредственное соприкосновение нанесенных на линию старта веществ с жидкостью, находящейся в лодочке.

На приготовленные таким образом листы фильтровальной бумаги, если указано в фармакопейной статье, наносят неподвижную фазу. Для этого соответствующие труднолетучие растворители (формамид, пропиленгликоль и т.п.) смешивают с легколетучими растворителями и в полученную смесь на 1 – 2 с погружают подлежащие обработке листы бумаги. Избыток смеси с поверхности листов снимают, обжимая их между двумя слоями фильтровальной бумаги, после чего летучий компонент смеси удаляют высушиванием на воздухе в течение 15 – 20 мин.

Если в качестве неподвижной фазы рекомендован водный раствор нелетучих веществ, то бумагу обрабатывают этим раствором, сушат, как указано выше, а перед хроматографированием выдерживают в камере, содержащей пары воды. Нанесение на бумагу легколетучих компонентов неподвижных фаз осуществляется путем выдерживания ее в парах фазы в камере непосредственно перед хроматографированием.

Детекция зон адсорбции

По окончании хроматографирования хроматограммы подсушивают до удаления следов растворителей и просматривают в видимом или ультрафиолетовом свете (при определенной длине волны детектора, указанной в фармакопейной статье), отмечая при этом зоны адсорбции. В ряде случаев для обнаружения зон адсорбции хроматограмму подвергают обработке специальными реагентами, образующими с анализируемыми веществами окрашенные продукты реакции, путем опрыскивания или погружения в раствор реагента.

Способ детекции зон адсорбции должен быть обязательно указан в соответствующей фармакопейной статье на лекарственное средство.

При бумажной хроматографии неподвижной жидкой фазой служит вода, адсорбируемая волокнами бумаги в количестве до 20%, ил другой полярный растворитель; в качестве подвижной фазы чаще всего применяют бутиловый спирт, коллидин, фенол, крезолы. Носителем служит хорошая фильтрованная бумага, достаточно однородная по толщине и плотности.

Для разделения смеси способом бумажной хроматографии каплю исследуемого раствора наносят на полоску фильтрованной бумаги шириной 15-20 мм и длиной 300-500 мм на расстоянии 20-30 мм от конца. Конец полоски погружают в соответствующий органический растворитель, предварительно насыщенной водой, а весь прибор помещают в герметическую камеру, атмосфера в которой насыщена парами органического растворителя и воды. Движение растворителя вдоль полоски бумаги, происходящее вследствие капиллярных сил, обеспечивает проявление хроматограммы, причем отдельные зоны перемещаются с различной скоростью.

Двумерная хроматография на бумаге

Еще более точные результаты получаются при помощи так называемой двухмерной хроматографии на бумаге. Для этого варианта применяют не полоски фильтрованной бумаги, а прямоугольники размером примерно 400Х500 мм. Каплю исследуемого раствора наносят вблизи одной из вершин прямоугольника, а Хроматограмму проявляют дважды различными растворителями, например фенолом и коллидином, сперва одним растворителем, а затем, после поворота на 90?, -другим.

Методы проявления хроматограмм

Восходящая хроматография. Бумага погружается нижним концом в подвижную фазу. Подъём жидкости происходит под действием капиллярных сил.

«+» Прибор прост, возможна количественная оценка результатов;

«-» Сила тяжести и капиллярные силы действуют в противоположных направлениях; скорость всасывания после подъема до 20 см сильно падает. Применима для веществ, имеющих достаточно большие различия в значениях Rf

Нисходящая хроматография. Бумага погружается в подвижную фазу верхним концом. Стекание жидкости происходит под действием силы тяжести.

«+» - быстрое прохождение подвижной фазы; отсутствие ограничения длины пробега пятен (проточная хроматограмма); возможно разделение веществ с незначительно отличающимися значениями Rf и количественная оценка результатов.

«-» - Прибор сложнее, чем для восходящей хроматографии.

Рис. 5.

Радиально-горизонтальная хроматография. Подвижная фаза непрерывно наносится в центр круглого листа бумаги.

«+» - Быстрое выполнение, зоны узки и резко очерчены; большая полнота разделения, чем для первых методов.

«-» - Возможна только качественная оценка результатов; применение «свидетелей» возможно только лишь при так называемом «секретном методе» (т.е. при делении бумаги на секторы).

Приготовление подвижной фазы

Ниже описан простейший случай хроматографии на бумаге - восходящая хроматография с водой в качестве восходящей фазы.

Компоненты выбранной системы растворителей смешивают в указанном соотношении в делительной воронке. Две несмешивающиеся фазы доводят при помощи встряхивания до взаимного насыщения; в качестве подвижной фазы выступает органическая.

Нанесение вещества

Из бумаги определенного сорта вырезают полоску, размер которой соответствует размерам применяемого для хроматографии цилиндра. На расстоянии 3 см от нижнего края карандашом наносят маркировочную линию. На этой линии через 2 - 2,5 см друг от друга и от краев полоски помечают точки старта. Специальной пипеткой наносят каждую точку старта; при этом образуются пятна около 1 см в диаметре. Затем растворителю дают испариться.

тонкослойный хроматография растворитель бумага

Проявление

На дно цилиндра наливают подвижную фазу и подвешивают полоску бумаги. Оставляют ее так висеть в течение ночи, а затем нижний край полоски погружают на 0,5 см в подвижную фазу. После того как растворитель поднимется на 20 - 25 см, полоску вынимают, отмечают карандашом положение фронта растворителя и Хроматограмму высушивают.

Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы,

называется хроматографией на бумаге.

Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, пред-

варительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным, адсорбционным или ионообменным. Пере-

мещение подвижной фазы происходит либо только под действием капилляр-

ных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).

При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бу-

маге круглые или овальные пятна (зоны). Совокупность пятен, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хро-

матограммой.

Подвижность вещества при хроматографировании характеризуется ве-

личиной R f , представляющей собой отношение расстояния от линии старта до центра пятна определяемого вещества к расстоянию от линии старта до линии фронта подвижной фазы (см. ОФС «Хроматография»).

Подлинность анализируемого вещества определяется при одновремен-

ном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и стан-

дартного вещества. Если образцы идентичны, соответствующие им пятна на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения R f . Для иденти-

фикации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и стандартного вещества. На хроматограмме должно набл ю-

даться одно пятно. Условия хроматографирования следует подбирать так,

чтобы значения R f были отличны от 0 и 1.

При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество должны иметь разные значения R f . При этом можно судить о степени чистоты анали-

зируемого вещества по величине и интенсивности окраски (или поглощения)

обнаруживаемых на хроматограмме пятен примесей. Содержание примесей может быть определено полуколичественно. Для этого на одном листе бума-

ги одновременно хроматографируют определенное количество анализируе-

мого вещества и несколько образцов определяемой примеси (свидетеля) c

различными, точно известными концентрациями. Содержание примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее пятно на хроматограмме по совокупности площади пятна и интенсивности окраски (или поглощения) с

пятнами свидетеля. При достаточном сходстве пятен примеси по форме и ок-

раске с пятнами основного вещества, взятого в том же количестве, допуска-

ется использование соответствующих количеств основного вещества в каче-

стве свидетеля.

Для количественного анализа применяют спектрофотометрические или видеоденситометры. Для обработки хроматограмм в видимой области спе к-

тра целесообразно использовать планшетные сканеры и соответствующее программное обеспечение.

Можно также провести количественное определение веществ после их экстракции с хроматограммы. Для этого пятна вырезают и экстрагируют оп-

ределяемое вещество. Содержание анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке после отгонки растворителя находят любым методом,

пригодным для определения малых концентраций.

ОБОРУДОВАНИЕ

Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизиро-

ванные камеры, изготовленные из инертного материала и позволяющие на-

блюдать за ходом процесса разделения при закрытой крышке камеры. Часто в качестве камер используют стеклянные стаканы или цилиндры с пришли-

фованной крышкой и дополнительно герметизированные. На крышке могут быть входные отверстия (шлюзы) для добавления растворителя или снятия избыточного давления в камере.

При проведении нисходящей хроматографии в верхней части камеры помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения, по крайней мере, од-

нократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать шири-

ну листа хроматографической бумаги. Камера должна быть снабжена уст-

ройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем по-

ложении и для ввода в лодочку подвижной фазы.

При проведении восходящей хроматографии подвижную фазу поме-

щают либо в лодочку, установленную в нижней части камеры, либо налива-

ют на дно камеры.

Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворите-

лей, входящих в состав подвижной фазы.

Подготовку оборудования, хроматографической бумаги и подвижной фазы приводят в частных фармакопейных статьях.

1.2. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ОФС 42-0094-09)

Хроматографический процесс в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (стеклянную, металлическую или полимер-

ную), называется тонкослойной хроматографией или хроматографией в тон-

ком слое сорбента (ТСХ).

Разделение может осуществляться по нескольким механизмам: адсорб-

ционному, распределительному, ион-парному, ионообменному, эксклюзион-

ному (гель-проникающему), хиральному или какой-либо их комбинации.

В результате движения анализируемого вещества и элюента под дейст-

вием капиллярных сил происходит разделение смеси исследуемых веществ на ее компоненты. При разделении вещества образуют на поверхности сор-

бента круглые или эллипсовидные пятна или полосы (хроматографические зоны).

Подвижность вещества при разделении характеризуется величиной R f

и R s (см. ОФС «Хроматография», уравнение 6 и рис. 1.4).

Параметры R f и R s используются для идентификации веществ и для оценки разделительной способности системы.

Испытание на подлинность (идентификация) анализируемых ве-

ществ проводится при одновременном хроматографировании одинакового количества анализируемого вещества и стандартного образца на одной и той же хроматограмме. При этом если вещества идентичны, то соответствующие им хроматографические зоны имеют одинаковую форму, интенсивность по-

глощения или окраски и равные величины R f .

При испытаниях на чистоту основное вещество и примеси в условиях хроматографирования должны иметь разные значения R f . При этом можно судить о степени чистоты анализируемого вещества по величине и интенсив-

ности пятен обнаруживаемых на хроматограмме примесей. Их содержание может быть определено полуколичественно. Для этого на пластинку наносят определенные количества анализируемого вещества и свидетелей. Для опре-

деления идентифицированных примесей в качестве свидетелей используют стандартные образцы идентифицированных примесей в количествах, соот-

ветствующих их предельному содержанию. Для определения неидентифици-

рованных примесей чаще всего используют растворы сравнения, приготов-

ленные путем разведения испытуемого раствора, как указано в частной фар-

макопейной статье. Содержание примеси в анализируемом веществе оцени-

вают, сравнивая зону примеси по совокупности величины и интенсивности с соответствующими пятнами свидетеля.

Количественное определение веществ на хроматограмме проводят,

как правило, денситометрически.

Основные приборы и материалы:

– пластинки с закрепленным слоем сорбента различных модификаций;

– хроматографические камеры;

– калиброванные капилляры и микрошприцы;

– устройства для нанесения на хроматограммы обнаруживающих реаген -

тов (пульверизаторы для опрыскивания, камеры для погружения хро-

матограмм в раствор и др.);

– вещества-стандарты, растворители, реагенты для обнаружения хрома-

тографических зон;

ультрахемископы с УФ-лампами на 254 нм и 365 нм.

Используемая лампа должна удовлетворять следующему тесту.

Проверка работы лампы. На пластинку силикагель G наносят 5 мкл

0,04 % раствора натрия салицилата в спирте 96 % для ламп с максимумом и з-

лучения при 254 нм или 5 мкл 0,2 % раствора натрия салицилата в спирте

96 % для ламп с максимумом излучения при 365 нм в виде пятна диаметром около 5 мм; пятно должно светиться.

При проведении анализов расстояние между лампой и хроматографи-

ческой пластинкой не должно превышать расстояния, используемого при проверке работы лампы.

Примечание. Используемый спирт должен быть свободен от флуоресцирующих веществ.

Хроматографические пластинки

Пластинка для ТСХ представляет собой твердую подложку (стеклян-

ную, металлическую или полимерную) с нанесенным слоем сорбента. Тол-

щина слоя сорбента от 0,1 до 0,25 мм для аналитического варианта и от 0,5

до 2,0 мм для препаративного.

Готовые хроматографические пластинки могут содержать флуоресци-

рующий индикатор для детектирования веществ, поглощающих в УФ-

области спектра при 254 и 365 нм.

Размер частиц сорбента для аналитического варианта ТСХ составляет

5–20 мкм. Наряду с такими пластинками можно использовать высокоэффек-

тивные хроматографические пластинки, содержащие сорбент с частицами размером 5–7 мкм. Такие пластинки позволяют увеличить эффективность разделения и уменьшить предел обнаружения хроматографических зон.

Выпускаются также пластинки с монолитными сорбентами и пластин-

ки с концентрирующей зоной (двухфазовые пластинки). Последние исполь-

зуются в фармацевтическом анализе для разделения сложных и гетерогенных смесей (экстракты из растительного лекарственного сырья, растворы табле-

ток со вспомогательными компонентами, мягкие лекарственные формы, сме-

Хроматографические камеры

Используют хроматографические камеры для вертикального или гори-

зонтального элюирования с герметичными крышками. Камеры для горизон-

тального элюирования снабжены также устройствами для подачи элюента на пластинку. Перед проведением анализа обычно внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, смоченной подвижной фазой. Для вертикального элюирования применяют камеры с перегородкой в центре дна.

Использование камеры для горизонтального элюирования позволяет осуществлять одновременное элюирование с противоположных сторон пла-

стинки, что увеличивает производительность анализа в два раза по сравне-

нию с использованием камеры для вертикального элюирования. При этом также уменьшается расход подвижной фазы приблизительно в 10 раз. В го-

ризонтальной камере движение подвижной фазы по пластинке происходит только за счет капиллярных сил, вклад гравитации при этом отсутствует, что повышает эффективность разделения по сравнению с камерами для верти-

кального элюирования.

Подвижные фазы (ПФ)

Подвижные фазы (элюенты) должны быть предпочтительно малоток-

ции ни с сорбентом (НФ, неподвижной фазой), ни с компонентами разделяе-

мой смеси. ПФ должны также достаточно быстро испаряться с поверхности хроматограмм после элюирования.

Для подавления диссоциации полярных молекул компонентов разде-

ляемой смеси к ПФ добавляют вещества кислого или основного характера

(модификаторы).

Нанесение проб

Если это указано в частных фармакопейных статьях, пластинки предва-

рительно промывают растворителем и активируют нагреванием в течение 1 ч

при 100–105 С в сушильном шкафу. Перед нанесением проб пластинки должны храниться в герметично закрытом эксикаторе. Нанесение проб осу-

ществляют:

– калиброванными капиллярами с тупым концом;

– поршневыми микрошприцами с тупым концом иглы;

– полуавтоматическими или автоматическими аппликаторами.

Нанесение осуществляют двумя способами: в виде пятен (2–5 мм диа-

метром) с промежутками между пятнами не менее 10 мм и в виде полос дли-

ной от 10 до 20 мм с промежутком между ними не менее 10 мм. Расстояние линии старта от нижнего края пластинки должно составлять не менее 10 мм.

Во избежание «краевых эффектов» размывания фронта ПФ в процессе элюи-

рования перед нанесением проб соскабливают с обеих боковых сторон пла-

стинки слой сорбента шириной 2–3 мм. Расстояния на стартовой линии от боковых краев пластинки до мест нанесения первой и последней проб долж-

ны составлять не менее 10 мм. В процессе нанесения проб недопустимо по-

вреждение сорбента на линии старта. Подсушивание нанесенных проб осу-

ществляют в токе холодного или теплого воздуха, либо на специальном столе с электроподогревом.

Способы элюирования

Используют следующие способы элюирования: восходящее элюирова-

ние (одно- и многоступенчатое, одномерное и двумерное – с поворотом пла-

стинки на 90 или 180) и горизонтальное.

Восходящая хроматография

Если не указано иначе в частной фармакопейной статье, пластинку с нанесенными пробами помещают вертикально в камеру, предварительно на-

сыщенную парами ПФ в течение 1 ч при 20–25 С. Уровень ПФ должен быть расположен ниже линии старта. Камеру закрывают и проводят процесс при

20–25 С в защищенном от света месте. После прохождения фронта ПФ рас-

стояния, указанного в частной фармакопейной статье, пластинку вынимают из камеры, сушат и проявляют в предписанных условиях.

При проведении двумерной хроматографии пластинку высушивают после хроматографирования в первом направлении и хроматографируют в направлении, перпендикулярном первому.

Горизонтальная хроматография

Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру и направляют по-

ток ПФ из лотка в камеру согласно инструкции к прибору для горизонтального элюирования. Процесс проводят при 20–25 С (если это указано в частной фар-

макопейной статье, одновременно с противоположных сторон пластинки). Ко-

гда ПФ пройдет расстояние, указанное в частной фармакопейной статье, пла-

стинку вынимают, сушат и проявляют в предписанных условиях.

Двумерную хроматографию выполняют как указано в разделе «Восхо-

дящая хроматография».

Способы обнаружения

Обнаружение (детектирование) хроматографических зон после прове-

дения качественной и полуколичественной ТСХ осуществляют следующими способами:

– наблюдением под УФ-светом;

– опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов;

– выдерживанием в парах обнаруживающего реагента;

– погружением в растворы обнаруживающих реагентов в специальных камерах.

Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

Эффективность разделения увеличивается как вследствие увеличения площади раздела подвижной и неподвижной фазы за счет уменьшения диа-

метра частиц сорбента, так и благодаря большей однородности размеров этих частиц. Применяют ВЭТСХ-пластинки, выполненные как в нормально-

фазовом (полярная НФ), так и в обращенно-фазовом (неполярная НФ) вари-

По сравнению с классической ТСХ использование высокоэффективных пластинок позволяет:

– увеличить число анализируемых проб за счет уменьшения диаметра стартовых пятен (до 1–2 мм) или длины полос (до 5–10 мм);

– уменьшить промежутки между стартовыми пятнами (до 5 мм);

– уменьшить время хроматографирования за счет уменьшения пробега фронта подвижной фазы (ПФ);

– уменьшить расход (объем) ПФ;

– снизить пределы обнаружения пятен и количественного определения определяемых веществ в 10–100 раз.

Применение ВЭТСХ обеспечивает получение более компактных пятен разделяемых соединений, что улучшает метрологические характеристики коли-

чественного определения с помощью сканирующей хроматоденситометрии.

Хроматография на бумаге (БХ)

Впервые метод бумажной хроматографии применили для разделения и идентификации аминокислот в 1943 г. В зависимости от природы процесса разделения БХ принято классифицировать как распределительную, адсорбционную и ионообменную. Методика БХ

(как и тонкослойной хроматографии) проста и оперативна, что в сочетании с требуемыми микроколичествами анализируемых веществ объясняет широкое распространение метода.

При хроматографировании на бумаге разделение анализируемых веществ происходит в результате многократных актов адсорбции на целлюлозе бумаги (или абсорбции в воду, пропитывающей бумагу) - в неподвижной фазе и актов десорбции в элюирующий раствор - в подвижной фазе. Бумага должна быть однородной по плотности, химически и адсорбционно-нейтральной. В настоящее время промышленность России выпускает четыре сорта хроматографической бумаги № 1, 2, 3, 4. Каждый номер отличается по плотности, следовательно, и по скорости движения растворителя. Бумагу № 1 и 2 называют «быстрой», а № 3 и 4 - «медленной». Выпускают и специальные сорта бумаги с высоким содержанием карбоксильных групп (для разделения катионов), а также - бумаги, содержащие иониты или другие адсорбенты.

Этот процесс проходит следующим образом. На полоску хроматографической бумаги наносят каплю раствора, содержащую смесь веществ, и дают ей высохнуть. Далее один конец бумаги опускают в сосуд с подходящим растворителем и его плотно закрывают.

Растворитель, двигаясь под действием капиллярных сил вдоль полоски бумаги, захватывает компоненты анализируемой смеси. В результате процессов сорбции - десорбции происходит разделение смеси на отдельные компоненты. Так же как и в тонкослойной хроматографии, качество разделения зависит от величины коэффициентов распределения компонентов - R/, характеризующих относительную скорость их перемещения по бумаге. Для качественного разделения на бумаге значения R/ компонентов должны быть в пределах 0,05-0,85.

Методика проведения анализа на хроматографической бумаге аналогична методике тонкослойной хроматографии. Существует несколько ее вариантов: одномерная, двухмерная, круговая и электрофоретическая. Как и в тонкослойной хроматографии, метод одномерной и двухмерной хроматографии предполагает восходящие или нисходящие потоки растворителя.

Выбор подходящего растворителя - достаточно сложная задача. Этот компонент, так же как и анализируемые вещества не должны резко отличаться по полярности и гидрофильным свойствам, иначе они или останутся на линии старта, или будут двигаться вместе с фронтом растворителя. Если вещество исследуемой системы остается на стартовой линии, это свидетельствует о его малой растворимости в подвижной фазе, в этом случае следует применить более полярный растворитель. Если же, наоборот, вещество движется вместе с фронтом растворителя (/?/= 1), то это означает, что оно слабо взаимодействует с неподвижной фазой, и для анализа следует выбрать менее полярный растворитель. Для сильногидрофильных веществ применяют смеси с высоким содержанием воды, например, насыщенный водой вторичный бутанол, верхнюю фазу смеси н-бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1: 5), систему изопропанол - аммиак, уксусную кислоту 15 % и т.п.

Вещества средней гидрофильное™, которые экстрагируются из воды этилацетатом, но не экстрагируются бензолом, хроматографируют с помощью растворителей средней полярности, например бу- тилацетатом или хлороформом с небольшими добавками полярных веществ или воды.

Для разделения веществ, практически не растворимых в воде, обычно в качестве элюентов используют бензол или циклогексан.

Иногда для оценки свойств веществ анализируемой смеси проводят ее предварительное хроматографирование (обычно в системе бутилацетат - вода). В зависимости от установленных таким способом величин R/ анализируемых веществ далее выбирают либо более полярные, либо неполярные смеси.

Так же как в тонкослойной хроматографии, для детектирования отдельных компонентов хроматограммы обрабатывают соответствующими реактивами, при взаимодействии которых с компонентами анализируемой смеси образуются окрашенные соединения. Количественное определение производят путем визуального сравнения интенсивности окраски или флуоресценции пятен пробы и стандартов, либо путем измерения размера пятна, предварительно определив зависимость между количеством вещества и размером его пятна на хроматограмме. Также возможно извлечение веществ из хроматографических пятен с последующим их физико-химическим анализом.